“ 可能你也曾是推行室老江湖🧪了，但谁不但愿我方细胞养的面子一些呢？本文适用于也曾插足推行室的小伙伴，莫得旨趣，王人是干货～ 提倡肃穆阅读！”

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基础操作

1. 允洽习用右手的超净台试剂布局

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2. 关于新细胞心需要不雅察摸索最适的消化温度和时辰，细胞破绽昭彰，大片阑珊可转移即可圮绝消化。有些细胞消化后不会变圆形，半沙状即可；

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3. 消化后需要轻轻拍打细胞壁面，震落细胞；4. 离心速率不宜过大，1000rpm/min相比适合5. 离心后2 mL重旋，呈潸潸状散开即可，吹散次数过多影响细胞活力，提倡熟习操作；6. 种板需一步完成，不可补加；7. 万古辰培养推行，最外圈应空出来，加入PBS或空缺/阴性对照，以防培养基挥发引起的旯旮效应；8. 把从液氮或-70℃水箱中取出的细胞在最短的时辰内放入水浴锅中进行解冻。9. 离心前须加入极少培养液。细胞解冻后二甲基亚砜（DMSO）浓度较高，留神加入极少培养液可稀释其浓度，以减少其对细胞的毁伤。如果冻存液的浓度是10％ DMSO，那么加10 ml以上的培养基就碰巧稀释到了无害浓度。但培养基越少细胞越容易贴附。10. 血清为羼杂物，不同品牌/批次存在各异，不同细胞适用血清品性存在各异，应作念好细胞试用筛选使命，再囤积宽裕量；胎牛血清在-20℃保存可达5年。11. 血清灭活处理：4℃溶解，置于56℃ 30 mins.如果血清灭活后有纤维卵白析出，属平素风景；12. 使用抗生素前，查询细胞关连培养特质，左证羞辱类型的鉴识，有针对性的处理；13. -80℃冻存后果有限，左证策画需求，合理冻存，半年以上推行提倡液氮冻存一批；

14. 左证不同的细胞类型弃取冻存的细胞密度。必要的推行进行细胞最好冻存密度测试。

典型的细胞冻存密度：1-10 ✕ 10^6 Cells/mL；

细胞长久高密度助长（长到90%-100%），更容易老化。且对数期细胞增殖速率快，容易聚团漂荡。应更具策画需要和细胞助长特质优化传代密度。

15. 细胞一朝分化/老化，很难逆转，无法通过外界养分体系和助长条目的转换“起死复活”。

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16. 小心取用无菌推行物品，勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，也不要在掀开的容器正上方操作推行。容器掀开后，以手夹住瓶盖并合手住瓶身，歪斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口向上摒弃桌面。17. 每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基换取也不分享培养基，以幸免装假稠浊或细胞间羞辱。推行扫尾后，将推行物品带出使命台，以75%乙醇擦抹无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。18. 离心管、冻存管等容器需用抗乙醇的象征笔标示本色物称号、操作日历、操作主说念主员姓名。要是细胞传代培养，更需注明现在的代数，以及这是团结代中的第几盘。19. 常用的生物安全柜应如期用75%乙醇对里面使命区域名义、侧壁、后壁、窗户进行名义净化；二氧化碳培养箱用75%乙醇喷洒消毒后擦干（每月一次）；增湿盘换水（2周1次），蒸馏水漂洗后无纺布或纸擦干，用75%乙醇喷洒消毒后擦干，可按比例添加Aquaguard-2支原体防御试剂（最好预热至37℃）。显微镜、离神思也应如期擦抹。20. 在开动养细胞并传代时，也要至极留神冻存细胞，以保持细胞有种子库存在，不错灵验幸免细胞毁伤。

21. 胰酶细胞消化液消化细胞时辰不宜过长，否则细胞铺板后助长状态会较差，作念流式时的CD Marker也可能会下跌。胰酶进行分装时尽量分装成多瓶，并苦守3次左右用完和只装2/3体积的原则。因为冷冻保存时液体体积会扩张，屡次使用团结瓶胰酶反复冻纠合裁汰消化后果并可能形成羞辱。胰酶适用于消化细胞间质较少的软组织和传代细胞，如胚胎、上皮、肝、肾等组织，但关于纤维性组织和较硬的癌组织后果较差。胰酶消化后果主要与pH值、温度、胰酶浓度、组织块大小和硬度相关。

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常见问题解答

细胞铺板后状态不好：可通过更换其他批次细胞系，优化胰酶消化条目，血清中庸量和时辰改善；细胞铺板不匀：消化过度容易形成细胞整片粘连，结团率高，很难通过奏乐散布；不同细胞接种前，最好进行梯度奏乐推行；加样从孔的左边靠底部缓缓加入；每孔之间细胞量不同：铺板速率尽量要快；每接几个孔细胞悬液需要混匀一下；加完半边板后，需要再次讲培养皿内剩余细胞悬液充分混匀后铺板。血清溶解后有絮状物：冷冻血清应置于4℃雪柜溶解，期间需均匀摇晃，溶解后按需分装冻存，幸免反复冻融，不宜在4℃长久储存。血清的样式依据血红卵白含量不同而变化。细胞羞辱排查：培养试剂和扶直试剂等条目不变，重新复苏一株细胞，复苏时留神水浴不行没过冻存管瓶盖，传代时不行触碰吸管尖头部或容器瓶口。操作前需要用75%的乙醇擦抹无菌操作台面。不雅察细胞是否有羞辱风景。血清羞辱排查：其他试剂不变，仅更换血清。基础培养基：其他试剂保持不变，仅更换基础培养基。

PBS：其他试剂保持不变，仅更换PBS。

胰酶：若细胞复苏的很好，一传代就羞辱，不错尝试其他试剂保持不变，仅更换消化用胰酶，看细胞状态。耗材：培养基及扶直试剂等条目不变，使用新耗材（培养皿或培养瓶、枪头）培养细胞，不雅察细胞是否有羞辱。细胞不贴壁：胰酶消化时辰欠妥。时辰短，易成团；胰酶处理太久，易形成细胞膜卵白毁伤，严重导致细胞失掉。困难贴壁因子：血清中含有促贴壁因子，无血清培养基，细胞贴壁后果下跌好多。其他原因：支原体或细菌羞辱；细胞状态不好，细胞老化；接种细胞数量少；复苏时处理速率太慢；培养液配制储存欠妥（eg:pH过碱，Gln太少）。贬责形态：

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贴壁变差：可符合加高血清比例（最高不进步20%）；提倡试好一个血清批次多囤一些，不错幸免血清批间差对细胞的影响。

细胞老化若何办？

防御细胞老化最主要照旧要作念到勤不雅察、勤换液、勤传代、勤保种，至极是传代，不行等细胞太密了之后传，一般细胞提倡长到70％交融度传代最好；

换培养液应该左证我方细胞浪费培养基的情况来详情是否该换。如果嗅觉时辰不好把合手的话就多培养几瓶细胞，在不同的时辰换液，临了再来相比下，看什么时候换液好，得出我方的论断；

弃取正确的血清与培养基：细胞对血清至极明锐，径直影响细胞的助长。一定要弃取允洽的血清否则就会因养分物资不配合而导致细胞老化；

在间充质干细胞培养方式必要进行消化，然而消化对细胞的名义卵白质有很强的絮叨作用，因此不行万古辰进行消化况兼在弃取消化酶时也要弃取较为合适的pH和浓度，否则就会使细胞老化粗略分化； 

293细胞感染病毒后凋一火严重：

通过更换血清批次，再进行转染推行并不雅察转染后的后果，相比分析出原因。

293传代：鉴于该细胞贴壁疏松，无为0.25%胰酶消化时辰摒弃15s-30s；奏乐行为温雅，摒弃在10-20次；细胞交融率达到80%传代即可传代，不可长的太满。

血清浑浊若何办？

血清产物中出现千里淀属于常见风景，无需过多惦记，况兼不会影响血清的品性，对细胞培养而言亦然莫得任何问题的，可平安使用。若思去除千里淀，咱们提倡您采选2000 rpm 离心5分钟，或用0.45 μm的过滤器去除千里淀。

03—生人留隐痛项

水浴锅未提前预热粗略未预热到37℃径直溶解。

水浴锅内冻存管太多，导致传热欠安，使溶解时辰延迟。

离心前健忘均衡，导致离神思损坏和细胞丢失。

一次复苏细胞种类过多，健忘更换吸头和吸管，导致细胞交叉羞辱。

判断细胞复苏告捷与否，需要看复苏后细胞贴壁率及细胞存活率。

如期查抄培养细胞的形态（即方式和外不雅）

① 细胞形态变化的迹象：细胞核旁颗粒的堆积、细胞质中有空泡、细胞团缩并从平板上脱离、外形变化

② 细胞形态变化原因：培养基转换、细胞羞辱、细胞老化、有毒物资

PH值降升高：

系数培养基尽量现配现用，2~8℃下避光保存一周内使用完；幸免操作时辰过长。操作时辰快速、减少同期进行的推行数量。

PH值裁汰：

① 实时传代、提升传代比例或裁汰血清量；② 符合减轻瓶盖；③ 增多培养液中NaHCO3浓度或减少培养箱内CO2浓度（NaHCO3含量在2.0 g/L到3.7 g/L之间时，对应的CO2浓度为5~10%）；

④要是微生物羞辱形成的，需实时丢弃培养基，并对操作、培养空间进行消毒处理。

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援用🔗：

[1] 本文本色来自于逍鹏生物，逍鹏生物对外泌体和细胞3D培养有关连老师分享。

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